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哮喘致敏小鼠模型的建立及脾脏CD4 + T细胞的分离

发布时间:2015-06-12 15:59 点击次数:

Establishment of sensitized asthma model in mice and CD4+T lymphocyte isolation from spleens
程晓明 ,王长征 ,李淑平 ,钱桂生    (第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所 ,重庆 400037)
 
  提  要 : 目的   建立一种可靠的哮喘致敏小鼠模型及分离脾脏 CD4+T 细胞。方法   采用卵蛋白致敏的方法建立模型 ,运用
panning 法分离 CD4+T 细胞。 结果   此模型小鼠肺组织呈现典型的哮喘样病理改变 ,其外周血、支气管肺泡灌洗液 (BALF) 中嗜酸性粒细胞百分比 ( EOS %) 显著高于正常对照组 ( P < 0. 01) 。CD4+T 细胞纯度经流式细胞术 ( FCM ) 检测 ,纯度达 97. 3 % 。 结论   此方法建立的模型及分离的 CD4+T 细胞可用于哮喘的实验研究。
 
  建立哮喘动物模型及分离高纯度的 CD4+T 细胞是实验研究哮喘发病机制的重要前提。本实验就小鼠致敏模型的建立及其脾脏 CD4+T 细胞的分离方法进行介绍。
 
1  材料与方法
1 . 1  主要试剂及材料
1. 1. 1  淋巴细胞分离液   将 9 % ficoll 400 溶液 ( Sigma 公司)和 33. 9 % 泛影葡胺溶液按比例混合 ,调比重至 1. 090。
1. 1. 2  尼龙毛柱的制备   称取 80mg 尼龙毛 ,将其细致撕匀后装入 2 ml 一次性注射器内 ,柱高约 4 cm。用 Hanks 液充分浸湿尼龙毛柱 ,使其内不留气泡 , 高压灭菌消毒。使用前用预温至 37 ℃的 RPMI 1640 (含 10 %胎牛血清 ,Fetal calf serum,FCS ) 洗柱后封闭下端出口。
1. 1. 3   CD8+单克隆抗体 (Monoclonal antibody ,mAb) 包被平皿的制备   取若干个聚苯乙烯平皿 ,将 CD8+mAb 溶液 (北京邦定公司) 100μ l 加入平皿中 ,并加入 0. 05 mol/ L 碳酸盐缓冲液 (pH9. 5) 3 ml ,混匀 , 室温下无菌放置 40 min ,磷酸盐缓冲液 ( PBS ,pH7. 2) 漂洗 ,加入含 1 % FCS 的 PBS ,室温下无菌孵育 15 min ,PBS 漂洗 ,4 ℃保存备用。
1. 2  实验动物及分组
   4~6 周健康 BALB/ c 小鼠 40 只 ,雌雄不限 ,体重 16~20 g ,由第三军医大学实验动物中心提供。将小鼠随机分为两组 ,A组为正常对照组 , 以生理盐水代替鸡卵清蛋白 ( Ovalbumin ,OVA , Grade Ⅱ, Sigma 公司) 致敏和激发小鼠 ;B 组为致敏模型组 ,给予 OVA 致敏和激发。
1. 3  致敏小鼠模型的建立
  分别于第 1 天、第 13 天经小鼠腹腔注射 OVA 10μ g 和氢氧化铝凝胶 (Al (OH)3) 20 mg 混合液 ;第 25 天时 ,将每只小鼠单独置于 5 L 密闭容器中 ,以 1 % OVA 进行雾化吸入激发 ,使小鼠暴露在 OVA 气雾中 20~30 min 直至出现哮喘样发作为止 ,持续 6 d 。由 402 型超声雾化器(上海合力医用器械厂) 提供雾化动力。
1. 4   外周血、支气管肺泡灌洗液 (Bronchoalveolar lavagefluid ,BALF ) 中嗜酸性粒细胞百分比 ( percentagesofeosinophils ,EOS % ) 计数及肺组织标本留取
1. 4. 1  外周血及 BALF 中 EOS %计数   各组小鼠各 14 只最后一次激发 24 h 后 ,经腹腔麻醉 ,行气管切开 ,收集 BALF 5ml ,针刺心脏取血约 0. 5~0. 8 ml 。将全部液体离心 , 收集沉淀细胞 , 加入红细胞裂解液去除红细胞。用 EOS 计数液行 EOS 计数。
1. 4. 2  肺组织标本留取   打开未经支气管肺泡灌洗的各组各 6 只小鼠胸腔 , 观察肺脏的大体改变 , 剪取部分肺组织 , 经10 %甲醛固定后切片 ,行 HE 染色。
1. 5   CD4+T 细胞的分离及鉴定
1. 5. 1   CD4+T 细胞的分离   
打开小鼠腹腔 , 无菌取出脾脏放入冷 Hanks 液中 ,将其捻碎并滤过 100 目无菌钢网 ,收集脾细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中 ,2 000 g 离心 30 min ,沿管壁轻轻吸出中间灰白色细胞层 ,重悬于含 10 % FCS 的 RPMI 1640溶液中 ;按每 1 × 108个细胞加入尼龙毛柱中 ,37 ℃,5 %CO 2 孵箱中孵育 1 h ;打开下端出口 ,使 T 细胞悬液以 40~60 滴 (Drop ,d) / min 流出 ,用 RPMI 1640 溶液反复洗柱至洗脱液达 6~8 ml ,将细胞悬液按每 1 × 107个加入 CD8+mAb 包被的聚苯乙烯平皿中 ,并加入 RPMI 1640 溶液 2 ml ,混匀 ,4 ℃作用 70 min ,每 20 分钟轻轻旋摇 1 次 ,沿平皿壁吸取细胞悬液并用 RPMI 1640 溶液轻洗 2 次 ,2 000 g 离心 10 min ,收集的细胞悬液即 CD4+T 细胞。经台盼蓝计数 ,细胞存活率 > 89 %。
1. 5. 2   CD4+T 细胞纯度鉴定   采用流式细胞术 ( Flow cytom 2etry ,FCM ) 鉴定 CD4+T 细胞纯度[ 1 ]。
1. 6  统计学分析
  各组结果以 € x ± s 表示 ,各组间比较采用非配对 t 检验。
 
2  结果
2 . 1  小鼠致敏模型的肺组织病理改变
  致敏组小鼠的肺脏与正常对照组小鼠的肺脏相比体积明显增大 ,表面肿胀 , 有多处形状不规则的暗红色充血区。切面有白色泡沫状渗出物 , 并可见明显的血管断面。肺组织切片HE 染色可见支气管及血管周围有大量的炎性细胞浸润 , 以EOS 为主 ,肺间质及肺泡腔内也可见 EOS 浸润。细小的支气管内可见粘液栓。气道上皮多处断裂 ,基底膜明显增厚且形态不规则。细支气管平滑肌发生肥厚性增生。
2. 2  外周血及 BALF 中 EOS %
2. 2. 1  外周血 EOS %   致敏组小鼠外周血 EOS % ( 11. 0 ± 2.7) 与正常对照组 (0. 7 ± 0. 5) 比较显著增高 ( P < 0. 01) 。
2. 2. 2   BALF 中 EOS %   正常对照组小鼠 BALF 中几乎没有EOS(0. 0 ± 0. 01) ,致敏组小鼠 BALF 中 EOS % ( 21. 9 ± 4. 4) 与正常对照组比较显著升高 ( P < 0. 01) 。
2. 3   CD4+T 细胞纯度鉴定结果
  经 FCM 检测 ,CD4+T 细胞的纯度为 97. 3 % ,见图 1 。

图 1   FCM 检测 CD4+T 细胞纯度

 
3  讨论
  本实验建立的 BALB/ c 小鼠致敏模型病理表现为 : 肺脏明显水肿 ,细、小支气管内有多量的粘液栓 ,气道上皮断裂、脱落 , 基底膜增厚 , 支气管及肺血管周围有以 EOS 为主的大量炎性细胞浸润 , 与哮喘的病理学特点相似 ; 同时 ,此模型小鼠外周血及 BALF 中 EOS %显著增加 , 与哮喘患者外周血及 BALF 中 EOS %的改变一致 ,说明此模型可用于哮喘的实验研究。
   Panning 法又称洗淘法。它是运用抗原与抗体相结合的原理进行细胞分离的一种方法 , 具有简便 , 经济、细胞完整性好等特点。国外在 90 年代早、中期即将这种方法广泛用于实验中。随着科学技术的不断进步 , 目前国外用于分离细胞的方法主要是磁珠分离法[ 2 ]和流式细胞仪法[ 3 ],但其造价昂贵 ,在国内并不能普遍开展 ,故运用 Panning 法分离细胞仍不失为一种高效、经济的方法。本实验用 Panning 法分离的 CD4+T细胞经 FCM 检测 , 纯度高 , 完全可用于进一步的实验研究。
  关键词 : 哮喘 ;模型 ;小鼠 ;CD4+T 细胞
  中图法分类号 : R - 332 ;R562. 25    文献标识码 : B

参考文献 :
[ 1 ] 沈关心 ,周汝麟. 现代免疫学实验技术[ M] . 武汉 : 湖北科学技术出
版社 , 1998. 180 - 183.
[ 2 ] Holmes B J , MacAry P A , Noble A , et al . Antigen 2specific CD8+T cellsinhibit IgE responses and interleukin 2 4 production by CD4+T cells[J ] . EurJ Immunol ,1997 ,27 (10) :2 657 - 2 665.
[ 3 ] Denkers E Y, Scharton 2Kersten T , Barbieri S , et al . A role for CD4+NK1. 1 + T lymphocytes as major histocompatibility complex class Ⅱinde2pendent helper cells in the generation of CD8+effectors function against in 2tercellular infection[J ] . J Exp Med ,1996 , 184 (1) : 131 - 139.
( 编辑  陈聪连)

技术方法
文章编号 :1000 2 5404 (2001) 03 2 0370 2 02
胰肾一期联合移植手术方法探讨
Exploration on operation methods in simultaneous pancreas 2 kidney transplantation
杨彤翰1,张银甫2,杨唐俊2,梁  平1,李  靖1,左国华1,杨清浩2,冯嘉渝2(第三军医大学附属新桥医院 :1肝胆外科 ;2泌尿外科 ,重庆 400037)
  提  要 : 目的   探讨胰肾一期联合移植手术方法中有关问题。 方法   采用原位低温灌注 ,整块切除的方法切取供胰。将供胰
移植于病人的右侧髂窝 ,供肾移植于左侧髂窝 ,供体十二指肠与受者的膀胱侧侧吻合。结果   5 例病人中 ,3 例术后胰腺及肾脏功
能满意 ,未使用胰岛素 ,进正常饮食 ,血糖一直在正常范围 ,肾功能良好 ,至今已分别生存 20 月、 14 月、 11 月。其余 2 例中 ,1 例因排斥反应 ,于术后第 47 天死于急性心功能衰竭。另 1 例因血栓形成 ,于术后第 33 天切除移植胰腺 ,但肾功能良好。
    结论 胰肾联合移植是治疗 Ⅰ型糖尿病伴肾功能衰竭的有效方法之一。
  胰肾联合移植术用于治疗糖尿病性肾病 , 国外开展较早 , 而国内则少有临床应用的报道[ 1 ]。我院于1998 年 12 月 15 日开始至今共实施 5 例 , 结合文献复习 ,本研究就术中有关问题进行重点讨论。

基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (39870946)  
作者简介 :程晓明 (1973 - ) ,女 ,安徽省淮南市人 ,博士研究生 ,医师 ,主要从
事哮喘方面的研究。电话 : (023) 68755320
收稿日期 :2000 2 08 2 19 ;修回日期 :2000 2 12 2 08
作者简介 :杨彤翰 (1947 - ) ,男 ,山东省莱州市人 ,教授 ,主要从事胰腺移植方
面的研究 ,发表论文 28 篇。电话 : (023) 68755114 2 74606
  收稿日期 :2000 2 10 2 10 ;修回日期 :2001 2 02 2 05

1  临床资料
1 . 1  一般资料
  男 3 例 ,女 2 例 , 年龄 41~53 岁 , 平均年龄 48. 4 岁。糖尿
病史 18~24 年 ,空腹 C 肽 1. 01~2. 2μ g/ L ,均长期使用胰岛素
治疗。每日用量 36~50 单位 ,空腹血糖仍在 13~32 mmol/ L 范
围内波动 ,尿糖 7 ~ 8 之间。 BUN 12. 8~26. 3 mmol/ L ,Cr 581~
939. 2 mmol/ L 。术前接受腹膜透析者 3 例 ,血液透析 2 例 ,透析